云南农业大学科学家用微生物组学技术探秘普洱茶渥堆发酵机理
2019-11-27 21:08:31   作者:赵明,马燕,陈立佼,吕才有   来源:云南农业大学    浏览:

基于团队十余年来对普洱茶微生物及发酵作用的相关研究,构建了普洱茶微生物发酵作用模型(图8)。

整合应用宏组学技术研究传统中国普洱茶发酵微生物组

原标题:重磅|我校科学家用微生物组学技术探秘普洱茶渥堆发酵机理

2019年11月20日,美国微生物学会(American Society for Microbiology)的期刊mSystems(IF6.52)以《整合应用宏组学技术研究传统中国普洱茶发酵微生物组》为题,发表云南农业大学龙润普洱茶学院赵明、吕才有教授团队与中国农业科学院作物科学研究所潘映红研究员、澳门科技大学伍建林教授合作的关于普洱茶发酵机理研究的新成果。

普洱茶饼

该论文首先根据食品微生物学知识,认为普洱茶的渥堆发酵是一个以茶叶为基质的自然接菌的食品发酵过程,而普洱茶则是与酸奶、泡茶等相似的发酵食品。并且根据普洱茶发酵系统中存在复杂而多样的微生物及演替,首次提出研究发酵微生物组(所有的微生物及其基因)。论文整合应用扩增子测序、宏蛋白组和代谢组的多维宏组学技术,系统研究普洱茶发酵菌群结构与变化、微生物组功能及代谢物动态变化,关联分析微生物群落及其酶参与的物质代谢,发现了微生物产生的与纤维素、木质素等茶叶多糖降解以及酚类物质代谢的关键酶,为进一步揭示普洱茶发酵核心微生物组的组成及功能,完善普洱茶发酵理论提供了有力的支撑。论文简要介绍如下:

一、普洱熟茶是云南传统特色发酵食品

发酵(Fermentation)是一种人类持续使用了数千年的利用微生物生长繁殖来加工食品的方法,通过发酵可改变食品营养结构、延长食品保质期等。目前常见的发酵食品包括酒精饮料、醋、泡菜、香肠、奶酪、酸奶、酱、面包等。据统计,发酵食品占全球食品和饮料消费量的三分之一左右,在保障人类食品安全与饮食健康方面具有重要作用。

云南普洱茶是国家地理标志保护产品(GB/T22111-2008),分为生茶和熟茶。其中,普洱熟茶是指以晒青毛茶为原料经过渥堆发酵加工而成的散茶或紧压茶。渥堆发酵是普洱熟茶加工的关键环节,是将晒青毛茶潮水加湿渥堆,并适时翻堆、潮水数次的过程。随着茶叶温湿度的增加,茶叶中的多种微生物大量生长繁殖,将茶叶内含物质进行分解、氧化、缩合等代谢转化,形成了普洱熟茶特有的风味、物质组成与保健功效。从食品加工或食品微生物学来看,晒青毛茶潮水渥堆是典型的微生物发酵过程,因此普洱熟茶是一种以茶叶为基质的发酵食品。

普洱茶冲泡

图1-普洱茶基本加工工艺

图1 普洱茶基本加工工艺

二、普洱茶发酵过程中有些什么微生物

普洱熟茶实质是自然接种微生物经过发酵形成的食品,弄清发酵中有什么微生物和他们的作用是揭示其发酵机理的核心任务。为此,研究者开展了普洱茶发酵微生物种类的研究。目前已分离并鉴定出曲霉属、青霉属、根霉属、犁头霉属和酵母属等29属真菌,以及游动放线菌属、链霉菌属、类芽孢杆菌属、芽孢杆菌属和乳杆菌属等细菌(图2和图3为笔者实验室在普洱茶发酵中分离的部分微生物)。

随着分子生物学技术的快速发展,多位学者开始应用分子生物学技术研究普洱茶发酵过程微生物多样性与动态变化。如,安倍道玄应用聚合酶链式反应变性梯度凝胶电泳技术发现黑曲霉和食腺嘌呤节孢酵母为普洱茶的优势真菌。我们前期应用454焦磷酸测序技术发现曲霉属始终是普洱茶发酵过程中的优势真菌,而根毛霉属在发酵中期成为优势菌。

图2 本实验室从普洱茶发酵分离并保存的真菌

图2 本实验室从普洱茶发酵分离并保存的真菌

图3 本实验室前期分离并保存的细菌

图3 本实验室前期分离并保存的细菌

三、微生物组学技术探秘普洱茶发酵机理

微生物组(Microbiome)指某个特定环境或者生态系统中所有微生物(细菌、古细菌、低等或高等真核生物和病毒)及其遗传信息(基因组)的集合。现代研究发现,微生物组是解释我们地球许多重要问题的核心。比如,人体肠道微生物细胞的数量是人体内细胞数量的10倍,其携带基因的总和是人类基因数目的100倍。有趣的是,肠道菌群的失衡不仅与胃肠道疾病,还与神经系统疾病、呼吸系统疾病、代谢性疾病、肝病、心血管疾病和肿瘤密切有关。基于以上,我们可以认为,微生物组在包括普洱茶发酵在内的食品发酵中也起着关键和核心作用,是普洱茶发酵研究的新方向。为此,笔者开展了普洱茶发酵的微生物组研究(图4),并获得一些有趣的结果。

图4普洱熟茶发酵微生物组研究技术路线

图4 普洱熟茶发酵微生物组研究技术路线

笔者研究发现随着发酵的进行,肠杆菌科细菌相对比例降低,而芽孢杆菌科细菌丰度增加;曲霉是发酵优势真菌,发酵中期蓝状菌和嗜热丝孢菌繁殖(图5)。

图5 酵过程细菌菌群组成与变化(A);发酵过程真菌菌群组成与变化(B)

图5 酵过程细菌菌群组成与变化(A);发酵过程真菌菌群组成与变化(B)

笔者观察到普洱茶发酵过程中:(1)茶多酚、游离氨基酸、儿茶素、水解单宁含量降低;(2)水浸出物、槲皮素、杨梅素、山奈酚和表儿茶素含量初期升高,发酵结束后显著降低;(3)可溶性糖、没食子酸和鞣花酸含量显著增加;(4)部分发酵过程咖啡因含量显著增加(图6)。

图6 发酵过程16个茶叶特征成分变化规律

图6 发酵过程16个茶叶特征成分变化规律

笔者从普洱茶发酵样品中鉴定到558个碳水化合物活性酶,包括糖苷水解酶、多糖裂解酶等。我们认为,发酵菌群产生碳水化合物活性酶,可降解植物或真菌多糖成为单体或低聚物,进而被菌群生长繁殖利用。这些酶可降解纤维素、木质素,破坏茶叶细胞壁,使茶叶变得柔软,并影响发酵样品多糖、果胶和可溶性糖含量。

研究发现,普洱茶发酵中多酚总量与大部分酚类物质含量降低,而没食子酸和鞣花酸含量升高,笔者挖掘众多与酚类物质代谢相关的酶,并构建儿茶酚代谢网络(图7),提出了普洱茶发酵过程酚类物质代谢途径:(1)糖苷水解酶水解酚糖苷,或糖基转移酶合成新的糖苷;(2)没食子酸酯被单宁酶水解产生没食子酸;(3)酚类物质被儿茶酚O-甲基转移酶、苯酚2-单加氧酶、水杨醛脱氢酶、水杨酸1-单加氧酶、儿茶酚2,3-双加氧酶、儿茶酚1,2-双加氧酶和槲皮素2,3-双加氧酶氧化、转化或降解。

图7 儿茶酚代谢网络

图7 儿茶酚代谢网络

四、微生物在普洱茶发酵中作用小结

基于团队十余年来对普洱茶微生物及发酵作用的相关研究,构建了普洱茶微生物发酵作用模型(图8)。概括来讲,细菌、酵母、霉菌等微生物首先利用茶叶的氨基酸、糖、蛋白质、脂类等成分,以供其生长繁殖;微生物产生糖苷水解酶、纤维素酶、果胶酶等碳水化合物活性酶,降解植物细胞壁的纤维素、木质素、半纤维素等多糖成分为寡糖、单糖,进一步供微生物的生长繁殖;微生物产生酚单加氧酶、过氧化物酶等可能催化多酚氧化;产生单宁酶、儿茶酚脱氧酶等,降解多酚;上述酶的作用,导致菌群生长和茶多酚、氨基酸等成分含量降低,而没食子酸、甲氧基苯类物质含量增加。

图8微生物在普洱茶发酵中作用示意图

图8 微生物在普洱茶发酵中作用示意图

文章共同第一作者(苏小琴)工作照片

文章共同第一作者(苏小琴)工作照片

赵明教授进行学术交流

赵明教授进行学术交流

赵明教授(班主任)带领2018级茶学一班开展茶叶加工实践

赵明教授(班主任)带领2018级茶学一班开展茶叶加工实践

作者:赵明,马燕,陈立佼,吕才有,来源:云南农业大学龙润普洱茶学院。转自:云南农业大学。

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